Home | News | Hacking | Sciences | Technology | Ti 92 | Programming | Free articles | Links | Webmaster


PURIFICATION DU LYSOZYME DE BLANC D’OEUF PAR CHROMATOGRAPHIE
D’ECHANGE D’IONS ET CONTROLE DE L’HOMOGENEITE DU LYSOZYME PAR ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE SDS


 

S

Ä Castry Glwadys and  Delbé Lionel

Ä Licence de biologie générale Université des Antilles Guyane
        faculté des sciences

Ä Travaux pratique de biochimie assuré par
         Th.MARIANNE PEPIN

Ä 18 janvier 2001

 

K

E

L

E

T

O

N

BUT MANIPULATION

PRINCIPE 

PROTOCOLE EXPERIMENTAL

bullet08_pieces.gifPURIFICATION

bullet08_pieces.gifDETERMINATION DE L’ACTIVITE CATALYTIQUE VOLUMIQUE 

bullet08_pieces.gifPREPARATION DE LA
SOLUTION DE
CUPROALCALINE ET DE FOLIN-LOWRY

bullet08_pieces.gif ELECTROPHORESE EN
PRESENCE DE SDS
 

bullet08_pieces.gifPREPARATION DU GEL DE SEPARATION A 10% 

bullet08_pieces.gifPREPARATION DU GEL DE CONCENTRATION A 5%

bullet08_pieces.gifMONTAGE DU GEL DANS LA CUVE

bullet08_pieces.gifDEPOT DES ECHANTILONS

bullet08_pieces.gifPROCEDE DE BRANCHEMENT  DE L'ELETROPHORESE

bullet08_pieces.gifREVELATION DE L'ELECTROPHOREGRAMME

ANALYSES ET RESULTATS

CONCLUSION 


 

PURIFICATION D ‘UNE PROTEINE LE LYSOSYME

  BUT DE LA MANIPULATION

La manipulation a pour objectif la purification du lysozyme (un enzyme) à partir d’un blanc d’œuf.
On réalise par la même une électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour mettre en évidence la présence
du lysozyme parmis les autres protéines du blanc d’œuf.

PRINCIPE

Le lysozyme représente environ 7 à 8% des protéines du blanc d’œuf et à pHi=11 , nettement supérieur à celui des autres protéine du blanc d ‘oeuf. Par conséquent la purification du lysozyme s’effectue grâce a une chromatographie échangeuse d’ions. Pour cela ,un échangeur faible de cations comme la carboxymethylcellulose est utilise car il est charge negativement. La purification s’effectue en trois étapes:
*Une phase d’absorption qui s’effectue avec un tampon a pH=10
A ce pH le lysozyme est encore charge positivement alors que les autres protéines de plus faibles pHi sont chargées négativement. Le lysozyme sera donc fixe a la carboxyméthylcellulose par interaction ionique
* Une phase de lavage qui a pour but d’éliminer les protéines libres et celles fixées non spécifiquement a la carboxymethylcellulose
* Une phase de désorption effectuée en présence de NaCl. Il y a donc au cours de cette phase compétition entre le lysozyme et les ions sodium qui finissent par se substituer au lysozyme fixe à la carboxymethylcellulose. Cette alternance est basée sur la force ionique du sodium supérieur a celle du lysozyme.
Les différentes centrifugations de la phase d’absorption et de lavage permettent d’éliminer les autres protéines chargées négativement.
Dans un deuxième temps afin de vérifier la présence du lysozyme, nous avons utilisé une solution bactérienne de Micrococcus. Les solutions protéiques en contact avec la solution bactérienne entraîne la lyse de la paroi des bacteries. En effet le lysozyme catalyse l’hydrolyse des liaison b 1-4 entre l’acide N-acetylmuramique et les résidus N-acetylglucosamine présent des les parois bactériennes. Les parois bactériennes absorbent à 450nm et leur lyse entraîne une diminution de l’absorbance ce qui permet de détermine l’activité catalytique de l’enzyme.
La troisième étape consiste à doser les protéines. Ce dosage est réalisé par la méthode colorimétrique de folin-lowry. Elles est basée sur deux réactions colorées:la réaction du biuret et la réduction de la tyrosine et du tryptophane par le réactif de folin-ciocalteu. Le maximum d’absorption du complexe coloré résultant se situe entre 650 et 700nm.Cette méthode est 100fois plus sensibles que la méthode du biuret. Les ions Cu2+ du réactif de folin en milieu alcalin par rapport à la solution cuproalcaline et la solution protéique forment un complexe cuivre protéique. Ce dernier ainsi que les résidus tyrosine et les tryptophane de la protéine réduisent les ions phosphomylobdates et phosphotungstates du réactif en dérives de couleur bleue. L’absorbance de ces solutions colorées est alors mesurée à 700nm.La concentration en lysozyme des différentes fractions est détermine à l’aide d’une courbe étalon A700nm=f(mg de protéine par tube)
Le dernier principe utilise est celui de l’électrophorèse en présence de SDS avec un gradient .L’électrophorèse est l’étude du déplacement des substances ionisées soumises à l’influence d’un champ électrique dans un milieu électrique conduisant le courant. Nous avons séparé nos fragments suivants le poids moléculaire(PM).
En effet l’utilisation d’un détergent comme le SDS charge négativement permet de dénaturer les protéines et de charger les sous unités négativement. Les molécules sont déposées du cote de la cathode et migrent vers l’anode. L’électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide, tamis moléculaire, utilisé pour séparer de petits fragments. Les petites molécules passent mieux à travers les mailles du gel et migrent plus rapidement et plus loin.
 

PROTOCOLE EXPERIMENTAL

 

OBTENTION DE LA FRACTION F0

On casse des oeufs et on ne récupère que le blanc ,dans un bêcher. Puis on procède a l’estimation du volume de blanc récupérer. Le volume de blanc est dans notre cas de 35ml.On pratique ensuite la dilution du blanc d’œuf avec du tampon tp10 ( tampon glycine NaOH,pH10; 0,1mol/l) jusqu’a un volume final de 200ml.Une fois la dilution effectuée on agite le mélange doucement afin d’éviter l’introduction d’air ,ce qui pourrait dénaturer le lysozyme. On filtre après sur laine de laine de verre.
Le volume désire pour la fraction F0 dilué au 1\4 est de 20ml.On prélève ainsi 5ml du filtrat ,que l’on complète avec 15ml de tp10.Dans un soucis de bonne conservation, cette fraction est placée dans la glace
 

 

PURIFICATION F0

La purification se compose de 3 phases essentielles au cours desquelles on utilise des produits facilitant chacunes de ces trois phases. Durant ces dernières nous obtiendrons des fractions comme le détails l’organigramme. La moitié de la fraction F0 es t prelevée puis additionner d’une grande quantité de carboxymethylcellulose(résine anionique) dans un tube Falcon. Le mélange est agite doucement a la main en évitant de produire des bulles. Il s’en suit 15 minutes(min) de repos ,et une centrifugation à 4°C,1500G durant 10 minutes. Suite à cette étape on récupère dans un tube à essaie le surnageant ,ce qui constitue notre fraction F0.
On poursuit la purification et l’obtention des autres fractions comme le détaille l’organigramme. Il est a note qu’un soin particulier est apporté à la centrifugation, en équilibrant le rotor de la centrifugeuse avec un tube Falcon rempli d’eau de poids moléculaire équivalent a l’autre tube Falcon contenant le mélange.
En fin de purification ,on procède à la détermination du volume de chaque fraction, puis l’on conservera l’ensemble au frais, afin de ralentir la dégradation

  

 

 

 DETERMINATION DE L’ACTIVITE CATALYTIQUE VOLUMIQUE

FRACTION

F0

F1

F2

F3

F4

F5

F6

DILUTION(d)

1\10

-

-

-

1\5

1\5

1\2

VOLUME FINAL (ul)

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

VOLUME DE FRACTION A PRELEVER (ul)

900

0

0

0

800

800

500

VOLUME DE TP6.2 à AJOUTER (ul)

100

1000

1000

1000

200

200

500

 Dans des tubes à hémolyse soigneusement numéroté on réalise les dilutions représente dans le tableau ci dessus.
Dans chaque tubes à hémolyse on dépose en premier le tampon 6.2(tampon phosphate pH=6.2 ;0.1mol/l),puis on rajoute le volume de la fraction à prélever de façon à compléter le volume au volume final. En prévision de la mesure de la densité optique (DO), on prépare 7 cuves de spectrophotomètre contenant chacune 2.9ml de Micrococcus et une cuve contenant de l’eau de minéralisée servant a réaliser le zéro du spectrophotomètre. Il est à noter que le micrococcus n’a pas été ajoute directement dans les tubes à hémolyse pour éviter de démarrer la réaction prématurément .Une fois la préparation terminée, on règle la longueur d’onde à 450nm et on effectue le zéro du spectrophotomètre. Des lors avec une micropipette on prélève 100ul de fraction que l’on ajoute au micrococcus contenu dans la cuve. On réalise alors une dilution au 1/30.On recouvre ensuite la cuve de parafilm et on agite par retournement, puis on enlève le parafilm et on place la cuve dans sa loge dans le spectrophotomètre. Il est a note que les étapes précédemment cites sont à effectuée rapidement car des l’ajout de la fraction ,la réaction démarre. On relève par la suite les DO toutes les 15secondes et cela durant 5minutes.Une fois les mesures effectuées pour la fraction F0 on répète le même procédé pour les fractions restantes de façon successive. Les résultats sont ensuite regroupes dans le tableau A1.

 

DOSAGE DES PROTEINES

GAMME D’ETALONNAGE

Pour doser les protéines des diverses fractions, il est nécessaire de disposer d’une référence que constitue la courbe d’étalonnage A700=f(mg de protéine par tube).A partir de solution de sérum albumine bovine (BSA)à 0.1mg/ml, on réalise une gamme régulière de 0 à0.1mg de protéine .On se limitera à pour cela de 6 points.

ETALON n°

1

2

3

4

5

6

VOLUME FINAL (ul)

2000

2000

2000

2000

2000

2000

VOLUME DE BSA A PRELEVER (ul)

200

400

600

1000

1600

2000

VOLUME D’EAU DISTILLE A AJOUTER

1800

1600

1400

1000

400

0

 

PREPARATION DE LA SOLUTION DE CUPROALCALINE ET DE FOLIN-LOWRY

La solution de cuproalcaline doit être préparer extemporanément à la réalisation des mesures. Ainsi on commence par préparer le réactif de folin diluée au 1/2 , en ajoutant successivement dans un erlenmeyer 4ml de réactif de folin et 4ml d’eau distillée et on homogénéise le mélange .Nous préparons ensuite la solution cuproalcaline selon la formule suivante: 

20volumes de A+1 volume de B+1 volume de C.

 Nous choisissons de préparer 110 ml de solution cuproalcaline en ajoutant dans l’ordre qui suit:
* 5ml de sulfate de cuivre (CuSO4)à0.5% =solution C
* 5ml de tartate de sodium et de potassium =solution B
* 100ml de bicarbonate de sodium (NaCO3) à 2% =solution A
Puis on homogénéise l’ensemble manuellement, en agitant doucement. On procède ensuite à la numérotation de tubes à essaies de F0àF6 et de deux autres tubes F0’ etF1’.Nous ajoutons dans les tubes à essais
-5ml de solution cuproalcaline
-1mlde mélange protéique (voir tableau ci dessous)
On agite doucement et on laisse reposer 5min à température ambiante ,puis on y ajoute 0.5ml de réactif de folin. On agite de nouveau et on laisse reposer 30min.

NB:Compte tenu du fait que dans certains cas les dilution F0 etF1 n’entraient pas dans la gamme d’étalonnage on a préparer les fractions F0’ et F1’ en prélevant respectivement 1ml de F0 et 1ml de F1 que l’on dilue au 1/2 grâce a de l’eau. 

FRACTION

F0

F0’

F1

F1’

F2

F3

F4

F5

F6

VOLUME FINALE (ul)

2000

2000

2000

2000

2000

2000

2000

2000

2000

VOLUME DE FRACTION (ul)

1940

1000

1940

1000

1800

1600

1400

1000

0

VOLUME D’EAU (ul)

60

1000

60

1000

200

400

600

1000

2000

DILUTION

1\50

1\100

1\50

1\100

1\10

1\5

1\3

1\2

1

 On réalise le zéro du spectrophotomètre avec un blanc d’eau(cuve contenant de l’eau) après avoir règle la longueur d’onde à 700nm.On réalise par la suite la mesure de lb’absorbance de chaque fraction

 ELECTROPHORESE EN PRESENCE DE SDS

La séparation s’effectue en fonction du poids moléculaire(PM),en sachant que les petites protéines sont moins chargées négativement et migrent plus rapidement que les grosses protéines qui sont plus chargées negativement.Pour pallier à ce problème de charge entre petites et grosses protéines et résolus en préparant un gel de gradient croissant de 10 à 30% en acrylamide en allant de la cathode vers l’anode

 * MONTAGE ET PREPARATION DE LA PLAQUE A ELECTROPHORESE

La plaque a électrophorèse sert à couler le gel. Elle se compose de deux vitres en verre de dimension différente, de deux espaceurs latéraux et d’un joint en PVC.Tous ses éléments laves avec du détergent ,rincés à l’eau distillée et séchés pour éliminer toutes traces d’eau .L’ensemble est ensuite monté comme le décrit les photo suivantes


 


Photo1 


Photo2 


Photo3 


Photo 4


Photo 5
 


Photo 6

1&2) Mise en place du joint sur la plus grande plaque de verre
3) Mise en place des espaceurs
4) Ajout de la seconde plaque de verre au-dessus des espaceurs
5) Fixation de la base des plaque de verre à l’aide de pinces
6) Ajout des pinces latérales
L’étanchéité du système est vérifié par l’ajout d’eau. Si l’étanchéité est bonne on retire l’eau et on sèche de nouveau sinon ,il faut reprendre tout le montage.

 

 

PREPARATION DU GEL DE SEPARATION A 10%

Dans un erlenmeyer de 50ml on prépare 30ml de gel en mélangeant de la façon suivante:
Acrylamide/bis -acrylamide 7.50ml
Tris HCl pH 8.8 11.25ml
SDS 10% 0.30ml
H2O 10.95ml
On ajoute au mélange obtenu des composés permettant la polymérisation du gel:
On prélève 30ul de TEMED que l‘on ajoute au mélange ,on agite puis on introduit dans le bêcher 300ul de persulfate d’ammonium à 10%.On homogénéise le mélange ainsi obtenu .Il est coulée rapidement entre les deux plaques de verre jusqu‘à 1.5cm du bord supérieur de la plus petite plaque grâce à une pipette pasteur .On recouvre ensuite le gel d’une fine couche d’eau d’environ 5mm afin de vérifier si le gel est droit. On laisse le gel polymériser 30min en évitant de le bouger.

PREPARATION DU GEL DE CONCENTRATION A 5%

Ce gel une fois coulé au-dessus du gel de séparation ,il permet la création des puits. Le gel est préparé en mélangeant
Acrylamide/bis -acrylamide 1.25ml
Tris HCl pH 6.8 1.25ml
SDS 10% 0.10ml
H2O 7.4ml
On obtient un mélange de 10ml,que l’on agite ,et que l’on additionne de 40ul de TEMED.Ce nouveau mélange est agité et après, on introduit 100ul de persulfate à10%.Une fois cela terminée on agite lentement le mélange jusqu’a ce que celui ci soit versé au dessus du gel de séparation. On évite ainsi la polymérisation du gel avant le versement. Le gel est versé rapidement pour qu’il ne polymérise pas lors du versement. Une fois lavé avec précaution ,le peigne est ensuite placé entre les deux plaques les dents dans le gel de concentration. L’ensemble est laissé à polymériser
 

DENATURATION DES ECHANTILLONS

Dans notre cas ,pour la dénaturation des différentes fractions on a réalisé préalablement une précipitation alcoolique afin de concentrer les fractions.. Dans des tubes eppendorf dont le bouchon a été percé on introduit pour chacunes des fractions F0 F1 F2 ,50ul de tampon de dénaturation et 50 ul de solution protéique de la fraction correspondante. Pour les fraction F3 àF6 on mélange 50ul de tampon à 100ul de solution protéique. On prépare en même temps un échantillon témoin de poids moléculaire.
Tous ces tubes sont portés à ébullition dans un bain marie pendant 4min.

MONTAGE DU GEL DANS LA CUVE

Une fois bien polymériser ,on enlève le peigne en le tirant doucement vers le haut. On enlève après cette étape le joint en le tirant d’entre les plaques. L’ensemble des deux plaque est placé dans la cuve en vérifiant la bonne étanchéité du système comme le détaille les figures ci dessous.

On procède maintenant à la préparation de 1 Litre de tampon de migration. A partir de Tris à 2M (molaire)on veut 25mM.Pour ce faire on prélève 12.5ml de tris que l’on verse dans une fiole de 1Litre.On ajoute ensuite 14.4g de glycine à 192mM,10ml de SDS à 0.1% et 777.8ml d’eau. Le tout est agité grâce à u agitateur magnétique jusqu’à dissolution complète de la glycine.
Une fois préparé le tampon de migration est versé dans les bacs supérieur et inférieur de l’appareil (cf. schéma).Le tampon permet la conduction ionique .

 

 DEPOT DES ECHANTILONS

Avec une seringue HAMILTON,on dépose 5ul de chaque échantillon protéique contenu dans les tubes eppendorf , respectivement dans un puit qui sera numéroté. L’aiguille de la seringue est introduite au fond du puit et on déverse lentement le mélange. On a ainsi 7 puits numérotés de 0 à 6 la fraction protéique correspondante. Dans un dernier puit on rajoute le marqueur de poids moléculaire

 

PROCEDE DE BRANCHEMENT

La cuve d’électrophorèse est montée entièrement et branchée à un générateur de courant continu qui délivrera durant 4 heures, un courant de30mA à 190 Volts de façon régulière.

 REVELATION

Le gel est retiré d’entre les plaques et coloré avec une solution de coloration pendant 30 minutes à agitation permanente sur un agitateur mécanique.
La solution de coloration se compose :
* Bleu de coomassie R250 à 0.25% (colorant des protéines)
* Isopropanol à20%
* Acide acétique à 20%
* Eau à 60%
On procède ensuite à la décoloration pendant 30 minutes sur agitateur, avec une solution de décoloration.Cette étape est répétée trois fois. La solution de décoloration se compose de:
* Isopropanol à45%
* Acide acétique à20%
* Eau
Le gel est après conservé dans une solution d’acide acétique à 5% pour nous permettre de l’observer par la suite. On réalisera à partir du gel un électrophorégramme en photocopiant le gel.

ANALYSES ET RESULTATS

 

FRACTION

F0

F1

F2

F3

F4

F5

F6

VOLUME (ml)

10

7

19.5

19.5

10

9.5

9.5

ABSORBANCE OBTENUE

0.279

0.269

0.175

0.039

0.003

0.055

0.023

DILUTION EFFECTUEE

1\50

1\50

1\10

1\5

1\3

1\2

1

QUANTITE DE PROTEINE PAR TUBE (mg)

0.085

0.083

0.055

0.012

0.001

0.016

0.008

CONCENTRATION EN PROTEINE LORS DU DOSAGE (mg\ml)

4.25

4.15

0.55

0.06

0.003

0.032

0.008

QUANTITE TOTALE DE PROTEINE (mg)

42.5

29.05

10.7

1.17

0.03

0.304

0.076

NOMBRE D’UNITE DE LYSOZYME (U)

12480

2214

1260

870

900

2520

768

ACTIVITE SPECIFIQUE (U\mg)

291.6

79.2

117.7

743.6

30000

8289

10105

Tableau global 1

 

TEMPS

F0

F1

F2

F3

F4

F5

F6

15s

0.779

0.773

0.775

0.782

0.791

0.780

0.781

30s

0.767

0.747

0.763

0.770

0.788

0.778

0.778

45s

0.752

0.719

0.748

0.763

0.787

0.770

0.774

1min

0744

0.700

0.735

0.755

0.785

0.767

0.771

1min15

0.733

0.675

0.726

0.748

0.783

0.763

0.768

1min30

0.722

0.654

0.716

0.737

0.782

0.760

0.764

1min45

0.707

0.635

0.702

0.731

0.781

0.753

0.761

2min

0.697

0.616

0.692

0.724

0.780

0.750

0.757

2min15

0.687

0.594

0.681

0.717

0.779

0.743

0.754

2min30

0.677

0.574

0.658

0.710

0.777

0.740

0.754

2min45

0.658

0.555

0.556

0.700

0.776

0.737

0.748

3min

0.654

0.534

0.650

0.694

0.775

0.730

0.744

3min15

0.645

0.516

0.638

0.688

0.773

0.727

0.741

3min30

0.633

0.498

0.625

0.681

0.772

0.718

0.732

3min45

0.625

0.479

0.617

0.672

0.771

0.718

0.732

4min

0.617

0.463

0.605

0.666

0.769

0.715

0.729

4min15

0.605

0.448

0.590

0.660

0.768

0.712

0.726

4min30

0.582

0.416

0.576

0.645

0.767

0.706

0.723

4min45

0.582

0.416

0.576

0.645

0.766

0.703

0.720

5min

0.571

0.404

0.565

0.637

-

0.696

0.717

DO

0.208

0.369

0.210

0.145

0.025

0.084

0.064

ACTIVITE CATALYTIQUE VOLUMIQUE (abs\min)

0.0416

0.0738

0.042

0.029

0.006

0.0168

0.0128

Tableau global 2

CALCUL DE L’ACTIVITE CATALITIQUE VOLUMIQUE

 

DO/Temps
ex: cas de F2 (0.773-0.404)\5=0.0738 absorbance/min
Le dosage du lysozyme est effectué indirectement par action du lysozyme sur les parois bactériennes de Micrococcus . La lyse des parois bactériennes se traduit par une diminution de l’absorbance à 450nm au cours du temps. D’une façon générale on observe qu’au cour du temps l’absorbance tend à diminuer ce qui caractérise la présence du lysozyme par son action sur Micrococcus. Les fractions F4 à F6 ont une absorbance supérieure à celle des autres fractions. Ceci peut s’expliquer par le fait que c’est dans ses fractions qu’a été récupérer le lysozyme lors de la désorption

CALCUL DU NOMBRE D’UNITE DE LYSOZYME

Le détermination du nombre d’unité de lysozyme repose sur le fait qu’une unité de lysozyme est la quantité d’enzyme qui induit une diminution d’absorbance de 0.001 à 450nm,pH=6.2 et température ambiante. On peut ainsi établir la formule suivante :
NU= (Activité catalytique * Volume de départ recueilli par fraction)*(1\d)*(1\0.001)
NU:nombre d’unité de lysozyme
d:dilution effectuée =0.1\3=1\30

exemple pour la fraction F0:
NU(F0) = 0.0416*10*30*(1\0.001)=12480
 

DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN PROTEINES

En établissant un rapport de correspondance entre la densité optique et la courbe d’étalonnage ,on a obtenu la masse de protéines pour 1ml de solution. La formule ci-dessous permet de déterminer la concentration en protéines dans chaque tube lors du dosage.
C1= quantité de protéines par tube*(1\d)
d :dilution
exemple pour F0 C1 :concentration en mg\ml
0.085*50=4.25

Nous déterminerons maintenant ,la masse totale en protéines des différentes fractions. La formule est:
M2=C1*Volume de départ recueilli
M2 :masse totale en protéines (mg)
C1 :concentration en mg\ml

exemple pour la fraction F0:
4.25*10=42.5mg
 

DETERMINATION DU RENDEMENT DE PURIFICATION

-F4\F0=(900\12480)*100=7.2%
-F5\F0=(2520\12480)*100=20.2%
-F6\F0=(768\12480)*100=4.7%

Le lysozyme n’est récupéré qu’à partir de la fraction F5,puisque c’est à partir de cet instant qu’a été introduit le NaCl. On rappelle que le chlorure de sodium (NaCl) permet de libérer le lysozyme en entrant en compétition avec ce dernier pour la carboxyméthylcellulose .Par conséquent on ne peut regrouper les fractions F4,F5,F6. Les seules fractions que l’on peut regrouper sont F5 et F6.

 PERTE DE PROTEINE LORS DU LAVAGE

Le lavage est effectué a l’aide de de tampon (Tp10) pour les fractions F2 et F3.On calcule les perte pour les fractions concernés en établissant un rapport de masse totale en protéines.
Fi : (Mi\M[F0] )*100 M=Masse de protéines en mg ,
1< i <6
F2 : (10.7\42.8)*100=25% F3 :(1.17\42.5)*100=2.7%

Le lavage est important ,car il a permis d’éliminer 27.7% des protéines présentes. Nous verrons qu’il a permis d’éliminer 10\35 des pertes totales en protéines.
Dans l’optique de la simplification de la manipulation ,on se demande s’il serait raisonnable d’éliminer la dernière étape du lavage (F3) et la dernière étape de désorption (F6).
Comme il est montré précédemment , la perte en protéines lors de l’étape F3 est de 2.7%. Cette perte n’est donc pas négligeable puisque qu’elle accroît les chances de purification du lysozyme de 2.7%. On ne doit pas par conséquent éliminer cette étape.
On sait que lors de la dernière étape de désorption ,on récupère 2.7% du lysozyme total. Sachant que l’intérêt premier de la manipulation est de détecter le lysozyme, et que l’on est certain d’avoir décrocher ce dernier (F5) ,il n’est pas nécessaire de réaliser la dernière étape. En effet on voit que en F5 , on récupère l’essentiel du lysozyme soit environ 20% ,alors que pour la l’étape F6 on ne récupère que 2.7%.
La question est de savoir maintenant si on retrouve la totalité des protéines mise en contact avec la cellulose.
Au départ (F0) on était en présence de 42.8mg de protéines .En sommant la quantité totale en protéines pour les fractions F1 à F6 ,on arrive à 41.33mg de protéines. On retrouve donc 96.6% des protéines totales mises en contact avec la cellulose.

 ANALYSE DE L’ELECTROPHORESE

L’électrophorégramme nous permet de mettre en évidence la présence des protéines. Celui ci représente la distance de migration en centimètre (cm) ,comparativement à celle de marqueurs de poids moléculaire (PM),pour chaque fraction. On rappelle que les composés les plus léger migrent le plus loin c’est à dire vers l’anode[+] car les protéines sont chargées négativement par les SDS.
On observe que pour les puits F0,F1,F2 ,F3 ,les bandes de migration sont identiques. Cela traduit la présence de protéines de poids moléculaire identique. C’est le cas pour les bandes de 66Kd (kilo daltons) ,45Kd ,36Kd. Ces bandes traduisent bien ce qui était attendu vu les résultats (tableau global 1) ,c’est à dire que les protéines autres que le lysozyme sont présentes et éliminés.
Ces protéines présentes sont :
§ Sérum albumine 66000 daltons
§ Ovalbumine 45000 daltons
§ Glycéraldéhyde 3 phosphate deshydrogénase 36000 daltons
Le lysozyme ne doit pas être présent au niveau de ces puits puisqu’il est encore fixé à la carboxyméthylcellulose
On peut remarquer la présence de bandes à 0.7 et 1.5 cm pour les puits F0 à F3.Or dans le blanc d’œuf il n’existe pas de protéines de si grand poids moléculaire. On en déduit qu’il ne peut s’agir que d’un ensemble de protéines qui se seraient associées. Il s’agit la d’artéfacts .
La surprise fut de taille en analysant les puits F4 ,F5 ,F6 qui caractérisent la phase de désorption. Aucunes bandes n’est visible.
En comparant les méthodes mises en oeuvre par des collèges ,on remarque que le défaut de bandes est du à au courant trop élevé (190 Volt ,30mA ) utilisé pendant 4 heures pour la migration. Ceci a entraîné un excès de migration qui a causé la sortie des protéines de faibles poids moléculaires du gels. C’est l’explication de l’absence du lysozyme dans les puits F4 ,F5 ,F6
Le fait de ne pas observer les bandes identiques à celles des quatre premiers puits , traduit bien la purification du lysozyme suite à l’élimination des protéines autres que le blanc..

NOM

POIDS MOLECULAIRE

SERUM ALBUMINE

66000 DALTONS

OVALBUMINE

45000 DALTONS

GLYCERALDEHYDE 3PHOSPHATE DH

36000 DALTONS

ANHYDRASE CARBONIQUE

29000 DALTONS

TRYPSYNOGENE

240000 DALTONS

INIBITEUR TRYPSYNOGENE

20100 DALTONS

LES PROTEINES DU BLANC D’OEUF

A partir de la migration des poids moleculaire on réalise une courbe étalon.
On trace la courbe PM= f(distance) pour déterminer à partir des distances sur l’électrophorégramme le poids moléculaire des protéines présentes.

Dessin de l’électrophorégramme ( à gauche : distance en centimètre ;à droite :Poids moléculaire )

 

CONCLUSION 

La technique de purification réalisée par chromatographie échangeuse d’ions et divisée en trois phases, se révèle comme efficace puisqu’elle a permis d’isoler le lysozyme à partir d’une spécificité. Cette méthode qui à le mérite d’être relativement rapide et peu onéreuse , nous a ainsi permis de purifier le lysozyme à 96.6%.Par la même l’absence du lysozyme lors de l’électrophorèse ,nous renseigne sur la sensibilité de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide et sur les précautions expérimentales qui doivent être prise lors de la migration









Mots clé:

Lysozyme , chromatographie, électrophorèse, enzyme , protéine ,résine anionique 

 

 


 Copyright © 2001 PGS SKELETON. Tous droits réservés.